蛋白定量是生物学、医学和生物化学研究中的基础实验技术，广泛应用于药物研发、疾病诊断、食品检测等领域。准确的蛋白定量不仅能保证实验结果的可靠性，还能为后续研究提供关键数据支持。本文将从蛋白定量的原理、常用方法、实验操作要点及常见问题解决方案入手，为您带来一篇实用且易懂的指南。

在许多实验中，蛋白定量是标准化样本的关键步骤。例如：

- 酶活性测定：需统一蛋白浓度以比较酶活力。

- Western Blot：确保上样量一致，避免因蛋白量差异导致结果偏差。

- 药物研发：精准测定药物靶点蛋白的表达量。

- 临床检测：如尿液蛋白定量辅助肾病诊断。
 

不同方法的原理和适用场景各异，需根据实验需求选择。

1、紫外吸收法（UV法）

- 原理：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸在280 nm处有特征吸收峰。

- 优点：快速、无需额外试剂，可同时检测DNA/RNA（260 nm）。

- 缺点：

- 灵敏度低（最低检测限约0.1 mg/mL）。

- 受杂质干扰（如核酸、多糖）。

- 适用场景：粗提蛋白的快速估算。

2、Bradford法（考马斯亮蓝法）

- 原理：考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后发生颜色变化（蓝→棕），在595 nm处吸光值与蛋白浓度成正比。

- 优点：

- 灵敏度高（检测限低至5 μg/mL）。

- 操作简单，5-20分钟出结果。

- 缺点：

- 易受去污剂、甘油等干扰。

- 不同蛋白因氨基酸组成不同，标准曲线需定制。

- 适用场景：纯化蛋白的快速定量（需注意干扰物质）。

3、BCA法（二喹啉甲酸法）

- 原理：在碱性条件下，蛋白质将Cu²?还原为Cu?，后者与BCA试剂形成紫色络合物（562 nm）。

- 优点：

- 抗干扰能力强（耐受去污剂、还原剂）。

- 稳定性好，颜色可稳定数小时。

- 检测范围广（20 μg/mL - 2 mg/mL）。

- 缺点：

- 需高温反应（60℃孵育30分钟）。

- 成本较高。

- 适用场景：复杂样品（如细胞裂解液）的定量。

4、Lowry法（改良酚试剂法）

- 原理：分两步反应：

1、碱性条件下，蛋白质与Cu??形成复合物。

2、加入酚试剂（Folin-Ciocalteu），与复合物中的酪氨酸反应生成蓝色产物（750 nm）。

- 优点：

- 灵敏度高（检测限低至5 μg/mL）。

- 适用于微量蛋白检测。

- 缺点：

- 操作步骤繁琐，需精确计时。

- 易受硫酸铵等试剂干扰。

- 适用场景：稀有蛋白样本的超微量检测。
 

1、试剂准备

- BCA工作液：按试剂盒说明书比例混合A液（含BCA）和B液（CuSO?），现配现用。

- 标准品：通常为BSA（牛血清白蛋白），配制梯度浓度（如0-2000 μg/mL）。

2、加样与反应

1、取洁净试管，加入标准品或待测样品（10-20 μL），补足PBS至200 μL。

2、每管加入2 mL BCA工作液，混匀。

3、60℃水浴30分钟（避免气泡），冷却至室温。

3、测吸光值

- 使用酶标仪或分光光度计，在562 nm处读取吸光值。

- 以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

4、计算样品浓度

- 根据标准曲线方程计算样品浓度，乘以稀释倍数即可。
 

1、标准曲线线性差

- 原因：标准品配制不准确、反应时间不足或温度不稳定。

- 解决：

- 精确称量BSA，用同批次稀释液配制标准品。

- 确保水浴锅温度均匀，避免边缘孔与中心孔温差。

2、样品浓度超出检测范围

- 原因：样本浓度过高或过低。

- 解决：

- 高浓度样本：用稀释液（如PBS）梯度稀释后重新检测。

- 低浓度样本：改用更灵敏的方法（如Bradford或Lowry法）。

3、重复性差

- 原因：加样误差、混匀不充分或反应时间不一致。

- 解决：

- 使用移液器并定期校准。

- 加样后立即涡旋混匀。

- 严格控制反应时间（如BCA法统一水浴时间）。

4、干扰物质影响

- 常见干扰物：SDS、Triton X-100、EDTA、甘油等。

- 解决：

- 选择抗干扰能力更强的方法（如BCA法优于Bradford法）。

- 对样本进行预处理（如丙酮沉淀去除杂质）。
 

1、标准品选择：优先使用与待测蛋白来源相同的标准品（如植物蛋白定量用植物源BSA）。

2、空白对照：用稀释液代替蛋白作为空白，避免试剂本身吸光值干扰。

3、数据记录：记录吸光值时保留三位小数，提高计算精度。

4、保存试剂：BCA工作液需避光保存，未用完的试剂不可重复使用。

蛋白定量看似简单，但细节决定成败。掌握原理、选择合适方法并规范操作，才能获得可靠数据。希望这篇指南能为您的实验设计提供清晰思路！