一、体外蛋白表达试剂盒实验前准备
试剂解冻与储存
CFPE Master Mix：从-80℃取出后置于冰上缓慢解冻，避免反复冻融(解冻后3小时内完成实验)。
阳性对照模板(T7P-GFP或LET)：储存于-20℃以下，解冻后同样需冰上操作。
关键提示：使用无核酸酶(Nuclease-Free)的耗材和试剂，防止DNA/RNA降解。
模板准备
质粒模板：需高纯度(如PCR纯化试剂盒处理)，洗脱液使用无核酸酶水，避免盐离子干扰反应。
线性模板：通过无缝克隆技术制备后纯化，浓度调整至10-100 ng/μL，确保蛋白质产量。
故障排查：若模板含核酸酶或抑制剂(如Cl?、SDS)，会导致表达失败，需重新纯化模板。
二、反应体系配置
反应体系设计
总反应体积：建议10 μL(可按比例放大)。
组分添加顺序：
9 μL CFPE Master Mix(EC或ECL)；
1 μL阳性对照模板(或目标DNA模板，终浓度10 ng/μL)；
阴性对照：9 μL Master Mix + 1 μL无核酸酶水。
关键提示：DNA模板对浓度敏感，需充分混匀，避免移液误差。
孵育条件优化
温度：29℃(水浴锅或培养箱预热至目标温度)。
时间：16小时(过夜孵育可提高产量)。
故障排查：若孵育后无表达，检查温度是否稳定(避免冷凝水进入反应管)。
三、蛋白表达与检测
表达验证
SDS-PAGE电泳：取1-2 μL反应液与5×Loading Buffer混合，95℃煮沸5分钟，跑胶检测目标蛋白条带。
荧光检测：若表达GFP等荧光蛋白，可直接用紫外灯观察荧光信号。
故障排查：若无条带，检查模板是否正确、反应体系是否污染(如核酸酶残留)。
包涵体处理
问题：原核表达中常见蛋白不正确折叠形成包涵体。
解决方案：
降低诱导温度(如16℃)和诱导剂浓度(如0.1 mM IPTG)；
引入分子伴侣共表达；
包涵体纯化后复性(常用尿素或盐酸胍变性，再通过稀释/透析复性)。
关键提示：复性需遵循“低温、低浓度、小梯度”原则，可添加PEG8000或精氨酸提高成功率。
四、蛋白纯化
粗分离与层析纯化
细胞裂解：超声破碎(功率30%，超声3轮，每轮2次，冰上操作)或高压匀浆。
离心过滤：12000 rpm离心30分钟，获取上清液。
亲和层析：
His标签蛋白：用Ni-NTA琼脂糖珠或磁珠纯化，洗涤缓冲液含20 mM咪唑，洗脱缓冲液含250 mM咪唑。
GST标签蛋白：用GST琼脂糖珠纯化，洗涤缓冲液含0.1% Triton，洗脱缓冲液含10 mM还原型谷胱甘肽。
故障排查：若纯化后杂蛋白多，可联用离子交换层析(如阴/阳离子交换柱)或分子筛(凝胶过滤)。
浓缩与缓冲液置换
超滤浓缩：使用30K超滤管，4℃离心浓缩蛋白至目标体积。
脱盐柱置换：将蛋白缓冲液置换为PBS或其他适宜缓冲液。
关键提示：超滤时避免蛋白沉淀(可添加甘油或DTT稳定蛋白)。
五、纯度验证与储存
纯度检测
SDS-PAGE：考马斯亮蓝染色，目标蛋白纯度应>90%。
Western Blot：用特异性抗体检测目标蛋白，减少非特异性背景。
HPLC：高效液相色谱进一步验证纯度。
故障排查：若纯度不足，检查纯化标签是否暴露全(如His标签被遮挡需优化表达条件)。
蛋白储存
短期储存：4℃保存(含50%甘油)，避免反复冻融。
长期储存：-80℃分装保存，添加蛋白酶抑制剂(如PMSF)防止降解。
关键提示：储存前需测定蛋白浓度(如BCA法)，并记录纯度数据。
六、体外蛋白表达试剂盒常见问题与解决方案总结
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
| 蛋白不表达 | 模板质量差、反应体系污染 | 重新纯化模板，使用无核酸酶耗材，检查阳性对照是否表达 |
| 包涵体形成 | 表达过快、缺少翻译后修饰 | 降低诱导温度/浓度，引入分子伴侣，包涵体复性 |
| 纯化后杂蛋白多 | 纯化方法单一、标签暴露不足 | 联用多种层析方法（如亲和+离子交换），优化表达条件使标签充分暴露 |
| 蛋白降解 | 细菌蛋白酶作用、序列不稳定 | 全程低温操作，添加蛋白酶抑制剂，检查蛋白序列N端原则，换用真核表达系统 |
| 储存后蛋白活性下降 | 反复冻融、储存条件不当 | 分装保存，避免反复冻融，优化储存缓冲液（如添加甘油、DTT） |
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